刘意单眼斜视和剥夺弱视大鼠视觉系统

摘要目的：分析单眼斜视、形觉剥夺弱视大鼠外侧膝状体视放射和视皮质的改变，以探讨其视觉发育可塑关键期及成年后视觉发育的可塑性存留程度。方法：选取13日龄SD大鼠60只，随机分为A、B、C3组，各20只，A组为正常对照组，不做任何处理；B组为斜视性弱视组，采用单侧眼外直肌切除术建立斜视性弱视模型；C组为单眼形觉剥夺性弱视组，采用单侧睑缘组织剪除+眼睑缝合术建立形觉剥夺性弱视模型。三组大鼠于视觉发育关键期早期(P25)，中期(P35)，末期(P45)以及成年后(P)，各取5只大鼠脑组织外侧膝状体、视皮质17区，行C-fos蛋白免疫组化染色，观察三组膝状体与视皮质内神经元形态学差异和光刺激诱导C-fos蛋白表达的阳性神经元的差异，并对P弱视成年大鼠视放射发育情况进行观察。结果：B、C组P25时大鼠模型眼C-fos蛋白阳性细胞水平显著低于对照组(P0.05)，B组大鼠非模型眼C-fos蛋白阳性细胞水平与A组比较无统计学差异(P0.05)，C组非模型眼C-fos蛋白阳性细胞水平显著低于A组(P0.05)。B、C组大鼠P35、P45、P时双眼C-fos蛋白阳性细胞水平显著高于对照组，组间比较差异有统计学意义(P0.05)。结论：成年弱视大鼠的膝状体及视皮质内神经元C-fos蛋白表达增加，提示其视皮质神经元存在一定程度的视觉可塑性。

关键词剥夺弱视；单眼斜视；视觉发育；C-fos

1前言

弱视是指在视觉发育敏感期，因各种不利因素影响视觉发育，最终导致以空间视力损害的视力不良综合征［1］。有研究报道［2］，年龄越小的弱视患者，治疗效果往往较好，成人则疗效不佳。另有研究认为［3］，哺乳动物出生后神经神经联系和突触结构可根据环境刺激而调整、改变，这时期称为视觉发育可塑性关键期。当动物成年时，视觉系统可塑性基本终止［4-8］。笔者为观察弱视大鼠外侧膝状体视放射和视皮质的改变，选取13日龄SD大鼠，分别建立斜视性弱视、单眼形觉剥夺性弱视模型，观察视觉发育不同时间点大鼠外侧膝状体视放射和视皮质改变，探讨其视觉发育各期及成年后的视觉可塑性，结果报道如下。

2材料与方法

2.1实验动物

选取出生日龄13日的健康SD大鼠60只，清洁级，雌雄不限，体重16.5-26.3g，平均21.4±2.93g，由本院动物实验中心提供。饲养室温23±3℃，湿度50-70%，大鼠自由进食、水，动物照度30lx，饲养光线工作照度lx，两种明暗交替时间为12h/12h至14h/10h，实验过程中对动物的处理严格遵循《实验动物管理条例》。

2.2仪器与试剂

GT-0NV视觉诱发电位仪、SOM20OD手术显微镜，购自重庆国特医疗设备有限公司；SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂，购自GE医疗集团；OlymPus生物显微镜、Leica图像拍摄系统胶图像分析软件，由Leica公司生产；小鼠抗大鼠C-fos单克隆抗体购自英国ABCAM公司；复方托吡、庆大霉素、盐酸氯胺酮注射液、盐酸氯丙嗦注射液，由北京市永康药业有限公司提供；水合氯醛、多聚甲醛，由广州化学试剂厂提供。

2.3模型建立与分组

60只SD大鼠，随机分为A、B、C3组，每组各20只，A组为正常对照组，不做任何处理；B组为斜视性弱视组，行单侧眼外直肌切除术，建立斜视性弱视大鼠模型。建模方法：左、右眼各10只进行模型建立，大鼠水合氯醛麻醉，眼睑常规消毒，沿角膜缘切开球结膜，分离眼外直肌，切除后彻底分离周围结缔组织及外侧韧带，形成内斜视，术毕与母鼠共同饲养。术后鼠眼睑伤口愈合后，采用角膜映光法测量斜视度，平均内斜15°-25°，模型建立完成。C组为单眼形觉剥夺性弱视组，采用单侧睑缘组织剪除+眼睑缝合术建立形觉剥夺性弱视模型。建模方法：水合氯醛麻醉，消毒眼睑，单侧上下眼睑睑缘自内毗到外毗各剪除1mm，对上下眼睑创面行褥式缝合，以密闭眼睑，左、右眼各10只，术毕与母鼠共同饲养。B、C组大鼠经闪光视诱发电位检测，确定弱视形成，建膜完成。

2.4实验方法

C组大鼠电生理检测完成以后，打开眼睑，与A、B组大鼠财放入黑箱饲养24小时，于P25、P35、P45、P时分别取5只大鼠，置自然光线中0.5小时，诱导视皮质内C-fos蛋白表达，后行快速灌注取材。取材步骤：水合氯醛腹腔麻醉，沿肋下缘开腹，暴露心脏及主动脉，将输液器针头由左心室刺入上行入主动脉，并由心脏外用持针器固定针头。剪开右心耳后开输液器，快速灌注生理盐水70mL，快灌注完毕时，再灌入4%多聚甲醛mL左右，控制在1小时灌注完成。灌注后，采用断头法迅速离断头部，取完整脑组织，以前至视交叉后至去除小脑修剪脑组织块，将修好的组织块放入福尔马林中固定6小时；固定好的组织块依次置于10%、20%、30%蔗糖中，待组织下沉，最后将组织块切为厚度10um的冰冻切片，贴于经多聚赖氨酸防脱处理的载玻片上，每份标本取切片10张，行免疫组化染色，对各组大鼠外侧膝状体及视皮质17区C-fos蛋白进行表达进行观察。

2.5结果判定

免疫组化检查对各组大鼠外侧膝状体随机选取10个视野进行分析，C-fos蛋白阳性细胞的平均光密度和阳性颗粒的百分率进行测算采用LeikaQ-Win图像分析系统进行。

2.6统计学处理

采用SPSS19.0统计软件处理本组资料，计量资料以(x±s)表示，采用t检验，P0.05为有差异有统计学意义。

3结果

3.13组大鼠膝状体组织C-fos蛋白阳性细胞水平比较

A组大鼠P25时C-fos蛋白阳性细胞水平最高，随时间推移呈逐渐下降趋势；B、C组P25大鼠模型眼C-fos蛋白阳性细胞水平显著低于对照组(P0.05)，B组大鼠非模型眼眼C-fos蛋白阳性细胞水平与A组比较无统计学差异(P0.05)，C组非模型眼眼C-fos蛋白阳性细胞水平亦显著低于A组(P0.05)。B、C组大鼠P35、P45、P时双眼C-fos蛋白阳性细胞水平显著高于对照组，组间比较差异有统计学意义(P0.05)，结果见表1。

表13组大鼠膝状体组织C-fos蛋白阳性细胞水平比较

组别

P25

P35

P45

P

A组

17.58±4.25

11.87±5.68

5.98±4.90

5.59±5.68

B组

模型眼

10.66±6.03

14.85±10.24

16.58±4.77

12.75±5.11

非模型眼

17.40±3.51

15.50±2.40

12.77±4.62

8.41±2.38

C组

模型眼

14.62±5.88

16.47±4.97

15.09±4.83

11.36±2.97

非模型眼

12.18±5.88

14.94±7.02

16.79±4.02

11.36±5.37

3.23组大鼠膝状体免疫组化结果

B、C组大鼠光镜观察结果显示，模型眼所支配的外侧膝状体细胞明显小于健侧眼所支持的外侧膝状体细胞，且Al区染色浅淡，A组大鼠外侧膝状体细胞正常，结果见图1。

A组B组C组

图13组大鼠膝状体免疫组化结果比较(×)

3.33组大鼠视皮质17区C-fos阳性细胞PLI值比较

3组大鼠C-fos阳性细胞PLI值均以P25时最高，随时间推移呈现逐渐下降趋势，A组大鼠P35期时C-fos阳性细胞PLI值显著高于对B、C组大鼠；B、C组模型眼同侧视皮质fos蛋白免疫阳性细胞PLI值均较A组显著增高，组间比较差异有统计学意义(P0.05)，结果见表2。

表23组大鼠视皮质17区C-fos阳性细胞PLI值比较

组别

P25

P35

P45

P

A组

13.94±5.16

11.12±3.90

6.72±1.65

6.03±0.22

B组

模型眼

13.27±6.21

8.79±1.44

8.23±1.80

8.99±3.10

非模型眼

13.38±3.38

9.67±4.87

9.10±0.68

9.64±3.02

C组

模型眼

14.53±2.68

7.99±2.69

9.48±1.85

9.22±4.37

非模型眼

13.48±2.61

7.86±3.53

8.58±1.85

7.99±2.17

3.43组大鼠视皮质17区免疫组化结果

A组大鼠电镜观察示，视皮质神经元大小一致，胞浆突起明显，fos蛋白在成年大鼠视皮质内几乎无表达；B、C组模型眼对应侧视皮质神经元数量目较A组明显减少，神经元体积变小，细胞核着色加深。B、C组大鼠蛋白无表达，其余五层内可见大量fos蛋白棕黄色免疫阳性表达。见图2。

A组B组C组

图23组大鼠视皮质17区免疫组化结果比较(×)

4讨论

有研究表明［9］，哺乳动物出生时视觉系统尚未发育成熟，出生后随外界环境不断刺激，视频觉系统才逐渐成熟。视觉系统发育早期具有可塑性，可因视觉剥夺、竞争或抑制等因素而形成弱视［10-15］。视觉诱发电位(F-VEP)是视网膜受到相应刺激后，视路传递电信号在枕叶视皮层引起的电活动，能客观反映视觉通路的功能状态，在斜视、弱视的诊断及疗效判断等方面广泛应用［16-18］。本研究中，A组大鼠视觉发育各期及成年后F-VEP的潜伏期、峰值比较无显著差异，与文献报道的视觉发育成熟时间相符［19］。

C-fos基因是即刻早期基因，参与调节细胞内的信息传递过程，可对突触刺激可产生快速、短暂的表达，能反应神经细胞兴奋性的变化［20］。有研究认为［21-24］，外来光刺激作用于视皮层胞膜上受体后，激活膜内第二信使与相应受体结合，产生兴奋性突触电位，引起神经元的兴奋，激活C-fos基因转录，翻译成fos蛋白，并进而控制晚期反应基因表达，发挥信使作用。另有学者提出视皮层细胞发育中的竞争机制和漂移学说［25］，认为在视觉发育关键期遮盖健眼，可解除健眼脑皮层的主动抑制作用，在剥夺视觉5个月后，摘除对侧眼可使被剥夺眼所驱动的视皮层细胞大幅提高，提示C-fosmRNA可反映视皮质细胞的功能状态。视觉发育可塑性关键期的终止在出生后40-45天，fos蛋应同样在其出生后40-45天终止表达［26-27］。本研究中，B、C组大鼠建立单眼斜视弱视和视觉剥夺性弱视模型，在视觉发育可塑性关键期早、中、末期及成年后，测定外侧膝状体和视皮质内C-fos蛋白表达情况。结果显示，A组大鼠视皮质内C-fos蛋白几近无表达，B、C组大鼠在视觉发育可塑性关键期末期及成年后，视皮质17区内第一层组织C-fos蛋白几乎无表达，其余五层均可见C-fos阳性细胞表达，提示视觉发育敏感性关键期后弱视大鼠视皮质内仍存在一定可塑性。笔者论据实验结果推测，在视觉发育关键期内发生的形觉剥夺性弱视，能使视皮质维持在一种初级或幼稚状态，可延长视觉发育可塑性关键期。当再次接受光照刺激后，视皮质内C-fos表达水平快速升高，可重新启动神经元可塑性机制。

本研究结果显示，单眼形觉剥夺和斜视性弱视大鼠视觉发育关键期末期及成年后，外侧膝状体及视皮质内神经元C-fos蛋白表达增加，提示已过视觉发育敏感期的成年弱视大鼠的视皮质神经元仍存留一定程度的视觉可塑性。

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